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如何制备密度梯度离心液?
发布时间:2011/3/3 13:50:53 发布者:武汉百特纯大分子科技有限公司 浏览次数:4877

密度梯度离心方法是分离生物小分子常用的方法,广泛用于病毒的分离纯化、亚细胞器、蛋白质、质粒DNA、RNA等的分离,其最显著的特点是获得样品的纯度高。

制备密度梯度离心液是密度梯度离心分离的前提条件。

如何制备密度梯度离心液?常见的制备方法有层铺法、冻融法、混合法和自动梯度法。

以5%-20%蔗糖溶液密度梯度为例:

梯度制备方法

 

层铺法

 

冻融法

 

混合法

 

自动梯度法

 

步骤复杂程度

 

a)配置不同浓度的蔗糖溶液5%、10%、20%

b)用移液器先将低浓度的蔗糖溶液加入离心管底,然后将吸头插入管底,加入较浓的溶液,此时浓度高的溶液将浓度低溶液顶到上层

c)如上述依次反复加入

a)配置20%浓度的蔗糖溶液

b)-40度冰箱冷冻至全部冻结,一般过夜

c)取出置于室温融化数小时即自成梯度

 

a)配置5%和20%最大和最小浓度的溶液,分别加入两个容器内

b)通过泵分别以同体积泵入第三容器混合后立即导入离心管中

 

a)只需1:1体积在离心管中加入高低浓度溶液

b)放入梯度制备器中离心即可

 

效率

1个/15min

1批/18hour

1个/10min

最快6个/1min

是否线性梯度

 

点梯度,非线性

 

曲线形梯度(分为凸指数和凹指数),非线性,梯度范围较窄,最低密度处常常是水溶液,难以支持上样时样品。

 

线性度较差,如果连续制备,只有第一管的线性梯度最好,后面几管的梯度越来越差,而且原溶液死体积大,浪费严重

 

完全线性

 

梯度重复性

 

差(即使同一个实验员)

较差

 

较差

 

超速离心过程

 

形成线性趋势的同时进行区带分离

直接进入区带分离

 

直接进入区带分离

 

直接进入区带分离

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